多种对虾病毒的现场快速高灵敏检测技术
2017-05-15 11:57:15
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技术概述：我国养殖虾类产量在2008年达到198万吨，占世界总产量的40%以上，对虾病毒病爆发给我国对虾养殖业造成损失在50亿元以上；开展对虾苗种病毒检测是避免病毒病大规模爆发流行减少损失的重要途径。
目前，有关水产动物病毒检测的常见方法的主要有六种，第一种是电镜观察法，第二种是TE染色法，第三种是病理切片法，第四种是抗体检测法，第五种是核酸探针杂交法，第六种是PCR（RT-PCR）检测法。电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长、准确性低；TE染色法和病理切片法都是基于病理学技术，不能直接对病毒进行检测，只能利用发病的组织病理征兆进行检测；抗体检测法和核酸探针杂交法是对病毒本身的蛋白质或核酸成分进行检测，不足之处在于其检测灵敏度较低，只能用于发病对虾或即将发病的对虾进行检测，病毒尚未引发感染或在感染的极早期很难用这两种方法检测；PCR检测法，虽然克服了前五种方法的缺点，在实验室条件下能实现对病毒的相对快速、准确检测，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，这大大限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。因此开发新的技术快速、准确、灵敏地检测虾类病毒，加强苗种和成虾检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展具有重要意义。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是2000年由Notomi 等发明的一种全新的等温扩增技术。该技术针对目的基因的6个区段，设计4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在65℃左右对核酸进行等温扩增。由于LAMP技术具有特异性高、操作简单、无需复杂仪器设备等优点，所以最近几年，该技术已开始广泛应用于生物致病病原的检测，例如人类重症急性呼吸综合征病毒（SARS virus）、艾滋病病毒（HIV）、埃博拉病毒 （Ebola virus）、流感病毒及动物狂犬病毒、H5N1型禽流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus）等。通过开展LAMP技术检测对虾病毒的研究，现已成功开发出实用性强、特异性高的对虾白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、黄头病毒(YHV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）、凡纳滨对虾诺达病毒（PvNV）、对虾杆状病毒（BP）等十多种虾类病毒的系列核酸等温扩增检测技术。
技术要点：
1.取对虾个体（仔虾、幼体和幼虾）或对虾鳃丝或附肢（成虾）样品磨碎至浆状；
2.用牙签蘸取浆状的样品分别采样用膜片充分润湿；
3.用吸管吸取A液，滴于采样用膜片上；
4.取新牙签将上述采样用膜片漂洗3分钟～4分钟；
5.采样用膜片、阳性及阴性对照膜片于95℃保温4 分钟，迅速置于冷水中2分钟；
6.将上述膜片转入反应液中57℃～60℃保温50分钟；
7.将反应液于90℃～95℃保温2分钟；
8.观察反应液颜色，如果显示绿色则表示该样品的病毒检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的病毒检测结果为阴性。
注意事项:
1.因该检测技术的灵敏度非常高，所以检测过程应严格按照操作指南进行，反应结束后不能打开扩增检测管，以防反应产物溅出污染后续检测样品导致假阳性的出现。
2.黑色背景更利于实验结果的观察。扩增反应结束后，可利用试剂盒说明书中提供的黑色背景进行观察。
目前，有关水产动物病毒检测的常见方法的主要有六种，第一种是电镜观察法，第二种是TE染色法，第三种是病理切片法，第四种是抗体检测法，第五种是核酸探针杂交法，第六种是PCR（RT-PCR）检测法。电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长、准确性低；TE染色法和病理切片法都是基于病理学技术，不能直接对病毒进行检测，只能利用发病的组织病理征兆进行检测；抗体检测法和核酸探针杂交法是对病毒本身的蛋白质或核酸成分进行检测，不足之处在于其检测灵敏度较低，只能用于发病对虾或即将发病的对虾进行检测，病毒尚未引发感染或在感染的极早期很难用这两种方法检测；PCR检测法，虽然克服了前五种方法的缺点，在实验室条件下能实现对病毒的相对快速、准确检测，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，这大大限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。因此开发新的技术快速、准确、灵敏地检测虾类病毒，加强苗种和成虾检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展具有重要意义。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是2000年由Notomi 等发明的一种全新的等温扩增技术。该技术针对目的基因的6个区段，设计4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在65℃左右对核酸进行等温扩增。由于LAMP技术具有特异性高、操作简单、无需复杂仪器设备等优点，所以最近几年，该技术已开始广泛应用于生物致病病原的检测，例如人类重症急性呼吸综合征病毒（SARS virus）、艾滋病病毒（HIV）、埃博拉病毒 （Ebola virus）、流感病毒及动物狂犬病毒、H5N1型禽流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus）等。通过开展LAMP技术检测对虾病毒的研究，现已成功开发出实用性强、特异性高的对虾白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、黄头病毒(YHV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）、凡纳滨对虾诺达病毒（PvNV）、对虾杆状病毒（BP）等十多种虾类病毒的系列核酸等温扩增检测技术。
技术要点：
1.取对虾个体（仔虾、幼体和幼虾）或对虾鳃丝或附肢（成虾）样品磨碎至浆状；
2.用牙签蘸取浆状的样品分别采样用膜片充分润湿；
3.用吸管吸取A液，滴于采样用膜片上；
4.取新牙签将上述采样用膜片漂洗3分钟～4分钟；
5.采样用膜片、阳性及阴性对照膜片于95℃保温4 分钟，迅速置于冷水中2分钟；
6.将上述膜片转入反应液中57℃～60℃保温50分钟；
7.将反应液于90℃～95℃保温2分钟；
8.观察反应液颜色，如果显示绿色则表示该样品的病毒检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的病毒检测结果为阴性。
注意事项:
1.因该检测技术的灵敏度非常高，所以检测过程应严格按照操作指南进行，反应结束后不能打开扩增检测管，以防反应产物溅出污染后续检测样品导致假阳性的出现。
2.黑色背景更利于实验结果的观察。扩增反应结束后，可利用试剂盒说明书中提供的黑色背景进行观察。
- 上一条微生物制剂在南美白对虾育苗中的作用
- 下一条影响对虾正常蜕壳的因素
